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Rothenstein liegt südlich von Jena am westlichen Ufer der Saale, der Ortsteil Oelknitz am östlichen Ufer. Während die örtlichen Felsen[1] einst die befestigte Fernhandelsroute zwischen Nürnberg und Leipzig über zwei Furten zwangen, führt die heutige Bundesstraße 88 ohne Flussquerung durch das Nadelöhr zwischen Steilhang und Fluss. Die B 88 wird seit dem 25. August 2022 über eine neue Umgehungsstraße sowie einen Tunnel[2] geführt. Direkt der Rothensteiner Hauptstraße verlaufen die Bahnstrecke Großheringen–Saalfeld und der Fluss.